LRRK2-в-1 CAS 1234480-84-2 біологічна активність

In vitro   

Wild-Type і G2019S трансдукції призводить до 2,5 разів вище TR-ЛАДУ сигнал, який може бути гальмуєтьсяLRRK2-В-1у дозі залежна від IC50 значення 0,08 мкм і 0,03 мкм, відповідно [1]. LRRK2-IN-1 володіє IC50 45 нм для гальмування DCLK2 і експонатів IC50 більше 1 мкм при оцінці біохімічних аналізів для AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 і PLK1. LRRK2-в-1 підтверджується перешкоджати MAPK7 з EC50 160 нм. LRRK2-IN-1 індукує дозу залежні інгібування Ser910 і Ser935 фосфорилювання супроводжується втратою 14-3-3 прив'язки як дикого типу LRRK2 і LRRK2 [G2019S] стабільно трансформувалися в HEK293 клітини [2]. LRRK2-в-1 є помірно цитотоксичною з IC50 49,3 мкм в HepG2 клітинах. LRRK2-в-1 проявляє гентоксичність при наявності і відсутності S9 при 15,6 і 3,9 мкм, відповідно [3]. LRRK2-IN-1 пригнічує проліферацію, міграцію і індукує клітинне смерть з ознаками апоптозу HCT116 і AsPC-1 клітин [4]...

У місті VIVO    

LRRK2-в-1 (100 мг/кг, і. п.) індукує дефосфорилювання LRRK2 в нирках мишей [2]. Peritumoral ін'єкції LRRK2-в-1 (100 мг/кг) призводить до значного зниження об'єму пухлини і ваги AsPC-1 пухлини ксеноплоти [4].

Кінази аналізу 

Активний ПОДАТОК-LRRK2 (1326-2527), ПОДАТОК-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), ПОДАТОК-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) і ПОДАТОК-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527) фермент очищається з глутатіону sepharose від HEK293 Cell лисіате 36 h після транзитної трансфуцій відповідних конструкцій Цднк. Пептидний кінази, виконаний у двох примірниках, встановлюються в загальному обсязі 40 μl, що містить 0,5 мкг LRRK2 кінази (що приблизно на 10% чистоти дає остаточну концентрацію 8 нм) в 50 мм трис/HCl, Ph 7,5, 0,1 mM egta, 10 мм MgCl2, 20 мкм nictide, 0,1 мкм [γ-32p] АТФ (500 СРМ/pmol) і зазначені концентрації інгібітора розчиненого в ДСО. Після інкубації на 15 хв при 30 ° с, реакція припиняється шляхом плямистість 35 μL реакції суміші на P81 фосфаноллютоз папір і занурення в 50 mM фосфорної кислоти. Проби вимиваються широко і включення [γ-32P] АТФ в Ністід в кількісному підрахунку. Значення IC50 розраховуються за допомогою "призму Графіта" з використанням нелінійного регресійного аналізу.

Клітинний аналіз

Клітини (104 клітин на свердловині), засіють в 96-добре тканини культури пластини в трьох примірниках. Клітини культивовані в присутності LRRK2-в-1 з ДДМ, як транспортний засіб при 0, 0,31, 0,63, 1, 2 і 5, 10 і 20 мкм. 48 h після обробки, 10 μL від TACS МТТ реагент додається до кожного колодязя і клітини інкубазовані на 37 ° с, поки темно кристалічний осад стають видимими в клітинах. 100 μL від 266 мм NH4OH в ДСО потім додають в колодязі і розміщуються на плиті шейкер при низькій швидкості протягом 1 хвилини. Після трясіння плита дозволена для інкубацій протягом 10 хвилин захищена від світла і OD550 для кожної свердловини читається за допомогою мікропластинчастого зчитувача. Результати усереднені і розраховані як відсоток від МСО (транспортного засобу) управління +/-Стандартна похибка середнє.

Тваринний адміністратор

LRRK2-В-1розчинений в Captisol і управляється внутрішньоперуального ін'єкції в дикий тип чоловічий C57BL/6 мишей при дозі 100 мг/кг. Керування мишами вводять з рівним об'ємом Captisol. На 1 і 2 год точок часу, мишей загахані через вивих шийки матки і нирок і тканин мозку швидко розчленований і оснащення заморожений в рідкому азоті.

Посилання

[1]. герменсон Сб, та ін. скринінг на нові інгібітори LRRK2 з використанням високої пропускної здатності TR-ЛАДУ стільникового аналізу LRRK2 Ser935 фосфорилювання. PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. EPUB 2012 28 серпня.

[2]. Ден, Xianming., та ін. характеристика селективного інгібітора Паркінсона захворювання кінази LRRK2. Природа хімічної біології (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. koshibu K, та ін. альтернатива LRRK2-в-1 для фармакологічних досліджень хвороби Паркінсона. Фармакології. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. вайгант н, та ін. невелика молекула кінази інгібітор LRRK2-в-1 демонструє потужну активність проти раку підшлункової залози шляхом інгібування двох-подібних кінази 1. Моль раку. 2014 6 травня; 13:103